我國首例非洲豬瘟的確診

摘要 ：近日，遼寧省沈陽市一養豬戶飼養的豬陸續發生不明原因死亡，病死豬剖檢發現脾臟異常腫大，疑似非洲豬瘟病毒感染。經國家外來動物疫病研究中心檢測，確診為非洲豬瘟病毒核酸陽性，B646L/p72 基因序列417 個堿基與俄羅斯毒株 100% 匹配， 與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）屬于同一進化分支。這是我國發現的首例非洲豬瘟，疫情來源有待進一步調查。

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，臨床上以高熱、網狀內皮系統出血和高死亡率為特征，易感豬群的病死率高達 100%。鑒于該病的嚴重危害性，世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。ASFV 不感染人，對人的健康不構成威脅。目前，針對 ASF 防控，尚無有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日，國家外來動物疫病研究中心接到遼寧省沈陽市沈北區發現 ASF 臨床可疑病例的報告（圖 1）。截至 8 月 1 日，發病豬場累計死亡 47 頭，對剛病死的 2 頭豬剖檢發現：脾臟極度腫大，嚴重梗死，質脆易碎，其中一頭豬脾腫大至少 10 倍，一頭豬脾腫大 5~7 倍；肺出血、質硬，有間質性肺炎變化；下頜淋巴結、腸系膜淋巴結出血，切面呈大理石樣變；胃漿膜面彌漫性出血；腎腫脹明顯、色淡，未見出血點；扁桃體見陳舊性出血，符合 ASF 癥狀。國家外來動物疫病研究中心立即開展病原學檢測，證實本次疫情由ASFV引起。這是我國歷史上的首次 ASF 發病記錄。

圖1  發病場地位置

1　材料與方法

1.1　病料 

病原學樣品：分別來源于 2 頭病死豬的剖檢病料，包括全血、脾臟、淋巴結、扁桃體；30 頭臨床健康豬的全血。血清樣品：2 頭病死豬及同群 30 頭臨床健康豬血清。 

1.2　病料 DNA 提取

在加有陶珠的組織勻漿管（Roche）中，加入600 μL PBS 緩沖液，再加入剪碎的組織樣品約 30 mg，使用 HyBaid RiboLyser 組織勻漿機進行勻漿處理。取 200 μL 組織勻漿液和全血，分別使用病毒 DNA 提取試劑盒提取 DNA。最后將提取的核酸于 ?80 ℃冰箱中保存備用。

1.3　熒光定量 PCR

依據文獻報道，用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的熒光定量 PCR 方法進行 ASFV p72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 king-s/king-a，TaqMan 探針為 ASFVP，同時以本試驗室合成的質粒 DNA 標準品為陽性對照。

1.4　普通 PCR

依據文獻報道，用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的 PCR 方法進行 ASFV p72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 PPA1/PPA2，產物長度為 257 bp，同時以本試驗室合成的質粒DNA 標準品為陽性對照。

1.5　測序片段 PCR 擴增

依據文獻報道，合成擴增 p72 基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U）。引物由上海生工生物技術有限公司合成。采用高保真的 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix 擴增 B646L/p72 基因片段，預期擴增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反應體系 為：2X Phusion Master Mix 25 μL，p72-D（10 μmol/L） 和 p72-U（10 μmol/L） 各 2 μL， 模板DNA 2 μL，用滅菌水補齊體積至 50 μL。PCR 反應程序為：98 ℃預變性 30 s；然后進行 35 個 PCR 循環（98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；最后 72 ℃ 10 min。

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